Mikrobiom-tesztek nyomában: 16S rRNS és Shotgun technikák összehasonlítása

A bélrendszer orvosi mikrobiológiája, a mikrobiom-kutatás, a bélrendszer mikrobiális betelepülését vizsgálja, ami az egészség szempontjából létfontosságú szerepet játszik. Ez a baktériumokból, vírusokból, gombákból és más mikroorganizmusokból álló mikrobiális közösség kölcsönhatásba lép a gazdaszervezettel, gyakorlatilag az összes szervrendszerrel kapcsolatban áll, befolyásolja az anyagcserét, a hormonokat, az immunrendszert, és az agyat is.

Az utóbbi években egyre többen fordulnak a mikrobiomvizsgálatok felé, akár emésztési panaszok, bőrproblémák, krónikus fáradtság vagy akár személyre szabott táplálkozási javaslatok miatt. Aki szeretne egy ilyen vizsgálatot végeztetni, hamar szembesül azzal, hogy nemcsak a szolgáltatók száma nőtt meg, hanem az általuk alkalmazott vizsgálati technológiák is különböznek.

Hagyományosabb székletvizsgálati módszerek közé tartozik a széklet makroszkópos vizsgálata: konzisztencia, szín, zsír-, nyák-, vérmaradványok, emésztetlen ételmaradványok megfigyelése, a pH érték megállapítása (ami utalhat diszbiózisra). Emellett immunológiai vizsgálatokat is alkalmaznak, például a rejtett vér kimutatását vagy bélrákra utaló markerek keresését. A gyulladásos és nyálkahártya-integritást jelző anyagok – mint a kalprotektin, laktoferrin, alfa-1-antitripszin és hisztamin – szintje szintén mérhető. A hasnyálmirigy külső elválasztó funkciójáról a pankreász elasztáz szintje ad információt. További klasszikus vizsgálatok közé tartoznak a mikroszkópos mikrobiológiai és parazitológiai elemzések, valamint a székletkultúrák tenyésztése. Kimutathatók Clostridium toxinok vagy a Salmonella jelenléte is.

Léteznek modern vizsgálati módszerek melyek nem a baktériumfajokat, hanem azok anyagcseretermékeit, azaz metabolitjait vizsgálják. Ilyenek például a triptofán, szerotonin, GABA, indol és származékai (pl. triptamin, kinureninsav, p-krezol), valamint a különböző epesavformák (szabad, konjugált, védő hatású vagy sejtkárosító). Ezek az anyagok fontos információval szolgálhatnak a páciens testi és lelki állapotáról, valamint a tünetek lehetséges okaival kapcsolatban. Hátrányuk, hogy nem minden esetben ismert, pontosan mely baktériumok vesznek részt az adott folyamatokban.

A technológia fejlődésével megjelentek genetikai alapú székletflóra vizsgálati módszerek. A leggyakoribb módszerek közé tartozik a 16S rRNS alapú szekvenálás és a shotgun metagenom szekvenálás.

Fontos megkülönböztetni az előbb említett mikrobiomvizsgálatokat a kórházakban rutinszerűen végzett klasszikus székletvizsgálatoktól, amelyek teljesen más célt szolgálnak. A kórházi székletvizsgálatok csupán néhány tucat ismert mikroorganizmusra terjednek ki, nem hivatottak átfogó képet nyújtani a bélmikrobiom teljes összetételéről vagy annak működéséről.

A 16S rRNS alapú szekvenálás: egyszerű, de korlátozott

A 16S rRNS-alapú elemzés ^1–2 napjaink egyik leggyakrabban alkalmazott módszere a bélmikrobiom feltérképezésére. Ez az eljárás a baktériumok egyik evolúciósan jól megőrzött, de fajonként enyhén eltérő génszakaszát, a 16S riboszomális RNS-t vizsgálja. A 16S rRNS szekvencia elemzése legtöbbször a nemzetség szintjéig pontos, ugyanis a gén egyes fajok között nagyon hasonló lehet, különösen közeli rokonok esetén. Tehát, míg a nemzetség (a „családnév”) világosan látszik, a pontos faj (a „keresztnév”) néha „elmosódik”.

A módszer nagy előnye, hogy gyors, költséghatékony és technikailag könnyen standardizálható, ezért széles körben alkalmazzák mind tudományos kutatásokban, mind kereskedelmi célú laboratóriumi elemzésekben. Népszerűsége az ezredforduló után, a DNS-szekvenálási technológiák fejlődésével párhuzamosan emelkedett meg. Számos nemzetközi kezdeményezés (American Gut Project vagy az Atlas Biomed) is ezt a technikát alkalmazza.

A módszer főként a baktériumok vizsgálatára korlátozódik, így más mikroorganizmusok, például vírusok azonosítására nem alkalmas. Ezen kívül csak korlátozott mértékben képes fajszintű azonosításra, és nem nyújt információt a mikroorganizmusok funkcionális tulajdonságairól, például arról, hogy termelnek-e toxinokat, metabolitokat, vagy rendelkeznek-e antibiotikum-rezisztenciával. Ez a technológia általában néhány ezer faj megkülönböztetésére képes.

Főbb előnyei:

• Egyszerűen kivitelezhető, gazdaságos, gyors
• Alkalmas a baktériumközösség általános feltérképezésére
• Széles körben validált

Korlátai:

• Csak baktériumokat vizsgál, más mikroorganizmusok (gombák, vírusok) nem észlelhetők vele
• Pontossága elsősorban nemzetségszinten érvényes, fajszinten kevésbé, vagy egyáltalán nem
• Nem ad információt a mikrobák anyagcseréjéről, működéséről

Shotgun metagenom szekvenálás: funkció és pontosság

A shotgun metagenomika ^3–4 egy korszerű, nagy felbontású vizsgálati eljárás, amely nemcsak a mikrobiom összetételét, hanem annak funkcionális működését is képes feltárni. A módszer lényege, hogy nem csupán egyetlen génszakaszt, hanem a mikrobiális közösség teljes DNS-állományát elemzi, így sokkal részletesebb és pontosabb képet ad arról, hogy milyen mikroorganizmusok találhatók meg a mintában, és azok milyen biológiai folyamatokban vesznek részt.

A technológia segítségével nemcsak baktériumokat, hanem vírusokat, gombákat, és parazitákat is azonosítani lehet. Emellett lehetővé válik az olyan funkcionális gének kimutatása is, amelyek anyagcserében, vitamin- és metabolittermelésben, toxintermelésben vagy antibiotikum rezisztencia kialakításában játszanak szerepet. Fontos hangsúlyozni, hogy a nagy mennyiségű genetikai adat önmagában nem elég, a valóban értékelhető eredményekhez megbízható, fejlett bioinformatikai algoritmusokra van szükség, amelyek pontosan képesek feldolgozni és értelmezni az adatokat. Számos vezető nemzetközi kutatóintézet és diagnosztikai szolgáltató (például a CosmosID, a Microba vagy az Onegevity) ezt a módszert alkalmazza.

Főbb előnyei:

• Teljes genomvizsgálat, fajszintű azonosítás
• Azonosít vírusokat, gombákat, archeákat
• Potenciálisan több tízezer baktériumfajt képes elkülöníteni
• Funkciókat is feltérképez: mit termelnek, mire képesek a mikrobák (rövid láncú zsírsavak termelése, metánképzés, toxintermelés, antibiotikum rezisztencia gének)
• Alkalmazható klinikai célokra és személyre szabott táplálkozási beavatkozásokra, lehetőséget adva a bélbaktérium-összetétel figyelembevételével történő célzott és specifikus korrekciókra. Ezek során bizonyos étrendi összetevők – például makrotápanyagok, egyes rosttípusok vagy növényi hatóanyagok – bevezetése, elhagyása vagy arányainak tudatos módosítása révén érhető el kívánt élettani hatás.

Korlátai:

• Költségesebb, mint az egyszerűbb módszerek
• Bonyolult adatfeldolgozást és értelmezést igényel

Shotgun és a 16S rRNS-alapú szekvenálás összehasonlítása

A 16S rRNS-alapú szekvenálás a baktériumok egyetlen, konzervált génjét célozza, így elsősorban nemzetség szintű azonosításra alkalmas, fajszinten korlátozott pontossággal. Ezzel szemben a shotgun metagenomika az összes mikrobiális DNS-t szekvenálja egy mintából, lehetővé téve a fajszintű azonosítást, valamint a funkcionális gének és anyagcsere-folyamatok feltérképezését is. A módszer nagy érzékenysége révén képes kimutatni minden olyan mikroorganizmust, amelynek aránya meghaladja a 0,01%-ot a mintában, és akár korábban nem ismert fajokat is azonosíthat. Emellett nemcsak baktériumokat, hanem vírusokat, gombákat és archaeákat is detektál, így komplexebb képet ad a mikrobiális közösségről.

Míg a 16S gyorsabb, olcsóbb és egyszerűbb megközelítést kínál, a shotgun metagenomika részletesebb és átfogóbb elemzést biztosít, igaz, magasabb költséggel és nagyobb háttér informatikai igénnyel jár.

Összehasonlító áttekintés

Mi miért a shotgun metagenomikát választottuk?

A shotgun metagenomikai vizsgálat, amivel dolgozunk, minden a tudomány által azonosított baktériumfajt kimutat, amennyiben az eléri a 0,01%-os, és minden gombafajt, ami eléri a 0,001%-os mérési küszöböt. Információt szolgáltat toxinokról, anyagcseretermékekről is, melyet a bélben jelen lévő baktériumok termelnek, arról is, hogy mekkora hányada az adott fajnak termel toxint, és kimutat rezisztencia géneket is, amit egy tervezett antibiotikus kezelés esetén figyelembe lehet venni az antibiotikum kiválasztásakor. Tartalmaz továbbá egy markert “humán háttér” néven, ez azt mutatja, a mintában talált bakteriális DNS-hez képest milyen arányban található humán DNS. A mintában talált emberi DNS származhat elhalt bélhámsejtekből, immunsejtekből (genny) vagy vérből, emelkedett értéke figyelemfelhívás, hogy bélhámsérülés, gyulladás, súlyosabb esetben esetleg daganat állhat fenn.

A baktériumok funkcionális jellemzőinek ismerete klinikai szempontból is kulcsfontosságú, hiszen például egy toxintermelő Escherichia coli teljesen eltérő kezelést igényel, mint egy húgyúti Escherichia fergusonii. Ugyanakkor nem kizárólag a jól ismert kórokozók okozhatnak problémát: bizonyos, alapvetően hasznosnak tartott baktériumok is ártalmasakká válhatnak, ha túlszaporodnak, mert ezzel felborítják a bél mikrobiális egyensúlyát, elveszik az életteret más hasznos baktériumoktól, amúgy hasznos anyagcseretermékeik túlzott mennyiségben súlyosan maró (pl. vajsav, szukcinát), vagy egyéb módon károsító hatásúak tudnak lenni, okozhatnak anyagcsere problémákat is (pl. tejsav). Az is lényeges szempont, hogy egy bizonyos baktériumfaj hasznos, vagy egy súlyos toxinokat termelő (pl. a Bacteroides fragilis) variánsa van-e jelen. Sok baktériumfaj képes enyhe, vagy komolyabb toxintermelésre, ennek ismerete segíthet a megfelelő terápiás stratégia, valamint a szükséges hatóanyagok pontos megválasztásában. A vizsgálat során kapott adatok alapján személyre szabott, az egyéni mikrobiom profilhoz, életmódhoz és egészségügyi célokhoz illeszkedő, lépésről lépésre felépített javaslatot állítunk össze, ami a problémától függően 1-3 hónapra szól.

Egyéb kapcsolódó vizsgálatok

A mikrobiom-elemzés mellett tünetskálák, egyéb laborvizsgálatok, vérvételi eredmények, gyulladásos markerek, allergia-, élelmiszerintolerancia-tesztek, hormonprofilok együtt adnak átfogó képet a szervezet aktuális állapotáról.

Az itt leírt információk nem helyettesítik az orvosi diagnózist, és nem is jelentenek útmutatást semmiféle betegség kezelésére.